活死細胞雙染試劑盒

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Calcein-AM/PI細胞雙染試劑盒 熒光特性：
Calcein-AM : λex=490 nm , λem=515 nm
PI : λex=530 nm , λem=580 nm

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Calcein-AM/PI細胞雙染試劑盒 染色案例：

                                                                           細胞染色實例

         

              （a）                                     （b）                                      （c）

1. Calcein-AM染FTC細胞（活細胞單染）
2.  PI染HCT116細胞（死細胞單染）
3. Calcein-AM、PI染MHD-1 細胞（活死細胞雙染）

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Calcein-AM/PI 最適濃度:
由于不同細胞種類、細胞濃度的染色條件不同，我們建議自行摸索一下Calcein-AM和PI的最適濃度。
Calcein-AM和PI的最佳濃度是根據(jù)不同的細胞種類而定，通過以下的操作，我們可以找到不同細胞染色試劑的最佳濃度：
1. 通過在0.1%皂苷或0.1-0.5%毛地黃皂苷中培養(yǎng)10 min或通過在70%乙醇中培養(yǎng)30 min制備死細胞。
2. 用0.1-10 μM PI溶液染死細胞，以便找到僅針對細胞核染色而不對細胞質(zhì)染色的PI濃度。
3. 用0.1-10 μM Calcein-AM溶液染死細胞，以便找到不對細胞質(zhì)染色的Calcein-AM濃度，再以此濃度的Calcein-AM對活細胞染色以檢驗活細胞是否被染色。

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Calcein-AM/PI細胞雙染試劑盒 實驗步驟
以HeLa細胞為例
制備1 mmol/l的Calcein-AM儲存液
【500 次】
將200 μl DMSO加入到含200 μg Calcein-AM粉末的管中，用移液器吹打溶解。
【3000 次】
將1 ml DMSO加入到含1 mg Calcein-AM粉末的管中，用移液器吹打溶解。
※Calcein-AM儲存液需要避光，在-20℃密封保存。

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使用方法
1. 工作液的配制
1.1 1×Assay Buffer（反應(yīng)緩沖液）的配制
從低溫冰箱內(nèi)取出10×Assay Buffer，根據(jù)單次用量無菌條件取出適量，用去離子水（dH2O）做10倍稀釋以得到1×Assay Buffer。
注意：低溫情況可能有析出現(xiàn)象，可在室溫情況下?lián)u勻使用。
1.2 1×染色工作液的配制
1）先將低溫保存的Calcein-AM溶液 (2 mM)和PI溶液（1.5 mM）回到室溫20-30 min。
注意：第一次使用可對母液進行分裝，以減少反復凍融次數(shù)。 注意：由于Calcein-AM的穩(wěn)定性比較差，此染色工作液必須現(xiàn)配現(xiàn)用，并且在當天用完。
2. 染色步驟
2.1  對于貼壁細胞，先用細胞刮刀或者胰酶-EDTA消化細胞，之后離心收集細胞（1000 rpm，3 min）。
對于懸浮細胞，直接離心（1000 rpm，3 min）收集細胞。
2.2  去上清，用1×Assay Buffer充分清洗細胞2~3次，以充分去除殘留的酯酶活性。
2.3  用1×Assay Buffer制備細胞懸液，使其密度為1×105~1×106細胞/mL。
2.4  取100 µL染色工作液加入200 µL細胞懸液內(nèi)，混勻，37℃孵育15 min。
注意：如果需要，可延長孵育時間至30min。
2.5  熒光顯微鏡下使用490±10 nm激發(fā)濾片同時檢測活細胞（黃綠色熒光）以及死細胞（紅色熒光）。另外，使用545 nm的發(fā)射濾片僅能觀察到死細胞。也可以直接在熒光酶標儀下使用合適的濾片進行檢測。
注意：可以使用以下方法來優(yōu)化得到兩種熒光染料的最佳工作濃度。
a）用0.1%皂素或者0.1-0.5%地高辛孵育細胞10 min，或者用70%乙醇孵育細胞30 min，從而制備死細胞；
b）用0.1-10 µM的PI溶液進行死細胞染色，以得到僅僅對細胞核染色，而不會對細胞質(zhì)染色的最佳工作濃度。
c）用0.1-10 µM的Calcein-AM進行死細胞染色，以得到不會對細胞質(zhì)染色的最佳工作濃度。然后用此濃度進行活細胞染色，去觀察是否活細胞能被染色。

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實驗注意事項
1、 由于本試劑盒中的Calcein-AM Reagent 粉末和PI Stock Solution量很少，有可能會粘在蓋子或管壁上，開封前請先渦旋以使其振落下來。
2、 由于Calcein-AM儲存液對潮氣敏感，請在使用后密閉Calcein-AM儲存液的蓋子。如果不能一次用完，建議分裝保存，例如分裝成10 μl/管，用封口膜封口，并用鋁箔紙包裹，放在一個密閉性能好的塑料袋中，并放入一包干燥劑，在≤-20℃密封避光保存。
3、 配制好的染色工作液請在當天使用。
4、 PI有疑似致癌性，使用前應(yīng)注意以下幾點：
a.使用時請帶好手套，口罩，防護眼鏡等，不要接觸到或呼吸到。
b.當PI不慎接觸到皮膚時，請立刻用大量的水沖洗。
c.處理方法
清洗容器的清洗液和廢液請按照實驗室的有毒有害物質(zhì)的處理方法進行處理，或按照以下方法處理：
用UV照射的方法進行分解
用次氯酸鈉氧化分解后，進行中和處理

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